Un nuovo strumento in Neurochirurgia restaurativa: creare nicchie per le cellule staminali neurali

I.A.Langmoen, M. Ohlsson, U.Westerlund, M.Svensson

Depatment of Clinical Neuroscience and Neurosurgery, Karolinska Institutet and Karolinska Hospital, Stockholm, Svezia

 

All’inizio del ventesimo secolo, Elizabeth H. Dunn, dell’Università di Chicago, ha dimostrato che neuroni immaturi possono sopravvivere dopo essere stati trapiantati nel cervello di un altro animale (7). Alla fine degli anni 1960 Lars Olson del Karolinska Institutet di Stoccolma ha iniziato una serie di esperimenti, che, alla fine, hanno dimostrato che neuroni fetali trapiantati possono stabilire connessioni funzionali con appropriati neuroni bersaglio. (33,34). Durante le successive tre decadi un grande numero di esperimenti sugli animali ha dimostrato che deficit neurologici di differenti condizioni neuro-degenerative sperimentali possono essere migliorati mediante trapianti neuronali. (4,5,32). Di conseguenza furono creati i termini di neurochirurgia cellulare, neurochirurgia molecolare e neurochirurgia restaurativa (2,23), iniziando così una nuova era nella quale neurochirurghi e ricercatori di base hanno iniziato a guardare attraverso una nuova finestra  per intravedere nel futuro eccitanti possibilità che possono arrivare molto lontano.

 

Trapianto di cellule embrionali

 

La malattia di Parkinson (MP)  è uno dei disordini neuro-degenerativi meglio descritti. La tipica degenerazione dei neuroni dopaminergici della substantia nigra è stata ben riprodotta in modelli ben caratterizzati di roditori e di primati, che simulano la caratteristiche cardinali della malattia e mostrano avere un buon valore predittivo- riguardo agli effetti degli interventi terapeutici- in pazienti affetti da MP (5,16). In modelli, sia sperimentali sia  nella pratica clinica, è stato tentato di restaurare la funzione mediante trapianti.

 

Le cellule usate per il trapianto sono prelevate dal mesencefalo ventrale fetale nella fase in cui i neuroni dopaminergici nigrali stanno andando incontro alla differenziazione terminale. Le cellule fetali trapiantate sviluppano un attività spontanea e, nelle aree bersaglio della crescita neuronale, la sintesi di dopamina, il suo ciclo e rilascio sono ristabiliti a livelli quasi normali. Questo si associa ad un significativo miglioramento dei deficit “clinici” negli animali (5,16).

 

Anche se i trials clinici sono stati pochi, hanno dimostrato risultati analoghi a quelli degli studi sperimentali (24,31) e diverse linee di evidenza supportano l’assunzione che il restauro funzionale sia conseguenza del trapianto: il grado della ripresa funzionale corrisponde in genere alla restaurazione dell’assunzione di [¹⁸F]fluorodopa nello striato trapiantato, vi è un graduale miglioramento in 6 –24 mesi e l’effetto è duraturo e predominanatemente controlaterale/omolaterale al lato del trapianto. Recentemente Freed et al (10) hanno riportato il primo studio in doppio cieco controllato con chirurgia finta: 40 pazienti sono stati sottoposti, in maniera random, a trapianti di cellule nervose o a finta chirurgia. Gli autori hanno riscontrato nel gruppo dei trapianti crescita di fibre a partire dai neuroni trapiantati in 17 pazienti su 20, come indicato alla PET da un aumento dell’assunzione di [¹⁸F]fluorodopa o all’esame autoptico. Il trapianto ha comportato un qualche miglioramento clinico nei pazienti più giovani, ma non in quelli più anziani ad un anno dalla procedura chirurgica.

 

La malattia di Huntington (MH) è un disordine degenerativo fatale ereditario, nel quale i pazienti presentano un progressivo peggioramento motorio, cognitivo e comportamentale. Anche se rimane sconosciuto il meccanismo responsabile della morte neuronale (che nella MH interessa particolarmente lo striato e la corteccia), si pensa che essa sia associata alla mancanza di proteina Huntingtin (9). Molti dei sintomi della MH risultano dalla mancanza delle connessioni inibitorie dello striato verso altre strutture, per esempio il globo pallido. Le caratteristiche neuro-patologiche, neuro-chimiche e comportamentali della MH sono state riprodotte in modelli sperimentali animali. Anche se, così come nella MP, il danno acuto negli animali da esperimento differisce da quello lentamente evolutivo della malattia umana, il modello si è dimostrato utile per studiare la capacità restaurativa dei trapianti neurali.

 

Nella MH la terapia restaurativa cellulare cerca di ristabilire le connessioni inibitorie dallo striato verso altre strutture, come il globo pallido.  In questi modelli cellule trapiantate embrionali si sono differenziate in neuroni maturi inibitori striatali, che hanno ricevuto input sinaptici da corteccia, talamo e la substantia nigra, e le cellule progenitrici trapiantate si sono sviluppate in una struttura simile allo striato nella sede del trapianto. Anche se i neuroni persi sono parte di un circuito cortico-striato-pallidale intricatamene organizzato, è stata osservata la inversione dei deficit lesionali sia motori sia comportamentali (6,21,35).

 

Questi risultati incoraggianti hanno giustificato trials clinici preliminari in pazienti umani affetti da MH ( 3,15,38,41). Philpott et al (8) riportano cambiamenti comportamentali in tre pazienti con MH, che hanno ricevuto un trapianto bilaterale di tessuto umano striatale fetale. Essi hanno visto, che tutti i pazienti mostravano, 4 – 6 mesi dopo la chirurgia, punteggi aumentati di alcuni parametri di funzionamento cognitivo, anche se il quadro dei miglioramenti non era uniforme nell’ambito dei soggetti.

 

Bachoud-Levi e al (3) hanno riportato risultati a lungo termine (3 anni dopo il primo trapianto) ottenuti in cinque pazienti affetti da MH: tre pazienti avevano benefici permanenti, mentre in due il trapianto non ha avuto successo. Come nel MP, l’insorgenza ritardata del miglioramento clinico, 9 – 12 mesi dopo il primo trapianto, suggerisce che il beneficio clinico sia correlato allo sviluppo dei trapianti striatali.

 

L’epilessia comprende un gruppo eterogeneo di disordini. Il meccanismo strutturale, neuro-chimico e neuro-fisiologico, che ne sta alla base, è molteplice. E’ probabile, che la causa dell’epilessia sia uno sbilanciamento tra eccitazione e inibizione e, in alcuni casi, anche, un cambiamento delle caratteristiche intrinseche dei neuroni (29).  Anche se l’eterogenicità dell’epilessia determina una maggiore difficoltà a stabilire dei bersagli per il trapianto, rispetto alla MP e MH, potrebbe essere trattata, quantomeno in teoria, mediante il trapianto di neuroni inibitori (22,27,40) nel foco epilettico o in strutture importanti per la propagazione e generalizzazione delle convulsioni. In pratica, comunque, gli effetti osservati sono stati transitori a causa del diminuito rilascio nel tempo di acido gamma-aminobutirrico (GABA) da parte dell’innesto e la riduzione della sensibilità dei recettori GABA nel tessuto bersaglio (22,27). In particolari tipi di epilessia , per esempio nell’epilessia temporale con sclerosi ippocampale, un area più ristretta in cui sono stati più precisamente descritti modificazioni strutturali, potrebbe essere che il trapianto di cellule staminali restauri parte di una rete locale e migliori così la condizione convulsiva. In questo contesto è di particolare interesse, che il quadro di perdite neuronali osservato nella sclerosi mesiale assomigli ai cambiamenti patologici osservati in seguito a ischemia globale e, che, inoltre, in questa condizione l’attivazione di progenitori endogeni conduca ad una massiccia rigenerazione locale. I progenitori endogeni non solo proliferano in risposta all’ischemia, ma essi migrano anche nell’ippocampo, rigenerano nuovi neuroni, sono integrati nei circuiti cerebrali esistenti e contribuiscono a migliorare i deficit neurologici esistenti (30). La restaurazione di quel tipo di difetto morfologico, osservato nella sclerosi mesiale, potrebbe essere teoricamente possibile, se imparassimo a conoscere  i segnali per la differenziazione neuronale. Anche se le basi scientifiche per trials clinici di trapianti nell’epilessia sono, nella migliore delle ipotesi, deboli, è stato eseguito il trapianto di tessuto porcino ricco di GABA (18).

 

Cellule staminali neurali

 

Per molto tempo è stato un assioma che il cervello adulto, al contrario di altri organi (per esempio la pelle o il fegato) mancasse della capacità di auto-riparazione e rigenerazione. Negli ultimi dieci anni è divenuto chiaro che cellule neurali staminali nel cervello adulto dei mammiferi continuamente generano nuovi neuroni, prevalentemente nell’ippocampo e nel bulbo olfattorio (14). Il termine cellula staminale neurale è usato poco distintamente per indicare cellule che 1) possono generare tessuto nervoso o sono derivate del sistema nervoso, 2) hanno qualche capacità di auto-rinnovo e 3) possono dare origine a cellule diverse da esse stesse mediante una suddivisione asimmetrica (11).

 

Sia cellule con auto-rinnovo a lungo termine e multipotenzialuità (cellule staminali neurali) sia cellule con capacità più limitate di crescita e di differenziazione (progenitori neuronali) sono state dimostrate esistere e persistere per tutta la vita in diverse specie di mammiferi, inclusi gli umani (43). Inizialmente si è visto che i progenitori sono abbondanti nelle aree periventricolari; recentemente è stata descritta la loro occorrenza in diverse regioni del sistema nervoso centrale, SNC, (36, 45, 46). Johansson e al (20) ha dimostrato che, sia la parete del ventricolo laterale sia l’ippocampo del cervello umano adulto, albergano cellule auto-rinnovantesi capaci di generare neuroni e cellule gliali, per esempio le cellule staminali neurali bona fide. A ulteriore conferma è stata scoperta la produzione di nuovi neuroni in diverse regioni del sistema nervoso centrale dell’adulto (12,37,39,43).

 

E’ stato, ulteriormente, visto che, sia fattori endogeni sia differenti insulti, possono influenzare la proliferazione di progenitori endogeni (1,8,13,19,26,28,44,47). Dato che i progenitori neuronali adulti sono abbondanti nell’ area periventricolare, sono sottoponibili ad un accesso diretto da parte di veicoli per il rilascio di geni e possono, pertanto, costituire un nuovo bersaglio per terapie farmacologiche e geniche dei disordini degenerativi.

 

Attualmente gli sforzi compiuti nel restaurare sottocategorie di neuroni o persino di reti neurali sono stati animati principalmente verso il trapianto di cellule embrionali (5,17), una strategia che, non solo, ha avuto successi limitati (vedi avanti), ma che ha anche stimolato discussioni etiche. La crescente evidenza dell’esistenza di progenitori endogeni dormienti  fa crescere spiccatamente la possibilità di strategie terapeutiche alternative, inclusi l’attivazione di cellule endogene da parte di certe manipolazioni e il trapianto di cellule trovate nel sistema nervoso centrale dell’adulto.

 

I neuroni maturi del SNC condividono alcune proprietà caratteristiche. Si tratta di cellule polarizzate, non mitotiche, con un singolo assone e molteplici dendriti, che comunicano tra di loro mediante il rilascio e il rilevamento di neuro-trasmettitori in corrispondenza  delle loro sinapsi. Nel tentativo di studiare, se cellule neurali staminali possono dare origine a neuroni pienamente funzionanti con queste proprietà essenziali, Song e al (42) hanno coltivato cellule staminali neurali clonate isolate dall’ippocampo di ratti adulti. Usando l’immunochimica, la microscopia elettronica, la microscopia a fluorescenza e l’elettrofisiologia hanno avuto forti prove, che dalla progenie di cellule staminali neurali di ratto, se coltivata assieme a neuroni primari e astrociti dell’ippocampo neonatale, si sviluppano neuroni elettricamente attivi, che si integrano nella rete locale di neuroni esibendo trasmissione sinaptica funzionale. Le cellule neurali staminali derivate da tessuti dell’adulto, così come quelle derivate da tessuti embrionari, possono, pertanto, mantenere la potenzialità di differenziarsi in neuroni funzionali con le proprietà essenziali dei neuroni maturi del SNC.

 

Un eloquente esempio di come l’attivazione di progenitori endogeni possa essere usata per restaurare la funzione nell’ippocampo è stato recentemente riportato da Nakatomi e al (30). Anche se è noto che l’ippocampo è un sito neurogenico attivo, solo i neuroni di un sottotipo, le cellule granulari del nucleo dentato (DG), sono generate continuamente mentre la produzione di altri nuovi neuroni in altre regioni dell’ippocampo sembra essere veramente limitata nell’adulto (39). Nakatomi e al (30) hanno dimostrato, che, dopo un trauma cerebrale ischemico,  per rimpiazzare neuroni piramidali CA1 possono essere stimolati in situ dalla infusione intraventricolare di fattori di crescita progenitori neuronali adulti. Questi neuroni CA1 neo-generati formano sinapsi funzionali e sono integrati nei circuiti cerebrali esistenti. Parallelamente all’induzione massiccia di nuovi neuroni ippocampali, il trattamento con fattore di crescita ha migliorato il deficit ippocampo-dipendente delle funzioni cognitive spaziali negli animali ischemici.  Futuri sviluppi di una serie di strategie per mobilizzare efficacemente progenitori endogeni faciliteranno una significativa riparazione strutturale e funzionale del SNC danneggiato dell’adulto, che si spera possa essere applicabile in futuro per curare diverse malattie umane, incluso l’ictus.

 

 La matrice extracellulare: una nicchia per le cellule stamianli neurali

 

Gli esempi copra citati indicano che, in futuro si può ottenere una restaurazione funzionale sia trapiantando specifiche regioni cerebrali dal feto, sia trapiantando cellule progenitrici dal cervello adulto sia manipolando cellule staminali o progenitrici dormienti. In passato il trapianto cellulare è stato ostacolato da obbiezioni morali o etiche, dalla inadeguata disponibilità di tessuto da donatori (il trapianto di tessuto primario necessita di svariati feti) e dall’inadeguata sopravvivenza del tessuto trapiantato. Liu e al (25) hanno riportato una nuova promettente strategia di ricerca, la quale, invece di focalizzare sulle cellule staminali in se, si concentra sul loro ambiente.

 

Entrambi i sistemi di segnalazione, intrinseco e estrinseco, sono importanti nella differenziazione e migrazione delle cellule staminali e nella sopravvivenza del tessuto trapiantato. I segnali estrinsechi includono un numero di fattori segnaletici solubili (tra i quali si trovano i ben conosciuti fattori di crescita come il fibroblastic growth factor e il epidermic growth factor) e fattori mediati dal contatto (per esempio il notch signaling system, che è il segnale più forte che si conosca per la gliogenesi).

 

Liu e al (22) riferiscono sull’ingegneria genetica della matrice extracellulare. La loro idea è, che si possa usare l’ingegneria molecolare formando diversi tipi di matrice extracellulare per creare nicchie permissive, nelle quali le cellule progenitrici possano essere dirette nella direzione desiderata. Essi hanno sviluppato tre diverse proteine per matrice extracellulare artificiale, che incorporano  il dominio attivo hJagged1 e hDelta1 in una base di elastina. Entrambi, hJagged1 e hDelta1, sono membri della famiglia DSL di leganti del notch-recettore, un sistema di segnale che istruisce il progenitore neuronale a scegliere un destino gliale. Il successo nella clonazione dei geni artificiali è stato confermato con appropriati enzimi restrittivi così come con la sequenzazione diretta dell’acido desossiribonucleico.

 

Oltre a riportare l’ingegneria genetica della matrice extracellulare, l’articolo di Liu e al (25) ci stimola a visionare nuove tecniche, con le quali le cellule staminali possono essere espanse clono-geneticamente in una ampia, rinnovabile risorsa di cellule trapiantabili (nicchia di rinnovamento) con le quali cellule staminali possano essere processate in un sottotipo appropriato (per esempio nicchia di processazione per cellule dopaminergiche), con le quali gli assoni possano essere guidati nella direzione appropriata (nicchia di guida) o con le quali una matrice artificiale extracellulare possa essere trapiantata assieme a cellule progenitrici per assicurare la sopravvivenza dell’innesto (nicchia di sopravvivenza). Le prospettive della neurochirurgia cellulare e molecolare e della neurochirurgia restaurativa sono realmente eccitanti.

 

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