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Neurochirurgia vertebrale Dr. Vincenzo Scaglione |
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Neurochirurgia vertebrale Dr. Vincenzo Scaglione |
La terapia genica comprende un gruppo di tecniche che intendono rilasciare e esprimere nelle cellule materiale esogeno a scopo terapeutico e per la ricerca di base. Per le applicazioni al sistema nervoso i neurochirurghi dovrebbero tenere conto, che i componenti di queste tecniche sono 1) il materiale genetico, che abitualmente è una sequenza di acido desossiribonucleico complementare (cDNA) associata a sequenze regolatorie addizionali (promotori, rinforzi o elementi regolatori) che consentono di esprimere il prodotto genico desiderato all’interno della cellula; 2) il vettore, che usualmente è derivato da un virus, dal quale tutti o la maggioranza dei geni virali sono stati rimossi al fine di minmizzare la tossicità virus-mediata. Lo scopo del vettore è rilasciare il materiale genco esogeno all’interno delle cellule.
I gliomi sono stati il soggetto del numero più grande e disparato di strategie di terapia genica. Di base è usato un virus per rilasciare/esprimere nelle cellule gliomatose un gene con effetti antitumorali. Sono stati usati vettori virali derivati da un retrovirus murino, un adenovirus umano e dal virus umano del herpes simplex 1. I geni rilasciati sono stati geni, che attivano agenti chemioterapici, geni che correggono una via soppressiva tumorale difettosa (p.e. quella p 53) e geni che stimolano la risposta immunitaria dell’ospite contro il glioma. Sono stati eseguiti negli adulti con gliomi maligni trials clinici di fase I/II. Uno degli approcci è stato testato in un trial di fase III (72). Un sottoargomento in questo campo è rappresentato da virus oncolitici (11), per esempio virus attenuati, che possono infettare e/o moltiplicarsi in cellule tumorali (fig.4).
Il gene più comunemente rilasciato è stato quello che codifica l’enzima timidin-kinasi (TK) mediato dal virus del herpes simplex 1 (63). Questo enzima attiva il precursore ganciclovir nel suo metabolica tossico (ganciclovir fosfato), che viene incorporato nel DNA delle cellule tumorali, danneggiando così il DNA e portando le cellule all’apoptosi (fig.3). TK è stato rilasciato con vettori retrovirali mediante l’iniezione stereotattica diretta (73), l’istallazione con reservoir di Ommaya (70) e l’iniezione a mano libera durante la craniotomia (24). In fase I e II sono stati curati gliomi maligni recidivati; in fase III, recentemente, sono stati trattati con iniezioni in fase di craniotomia glomi maligni diagnosticati per la prima volta. La craniotomia è stata seguita da trattamento con ganciclovir e radioterapia. Lo studio di fase III non ha dimostrato efficacia, anche se è stata riportata l’evidenza aneddotica di effetti benefici (72). La mancanza di efficacia può essere attribuita ad una serie di fattori, ma una delle ragioni principali potrebbe essere attribuibile alla relativamente scarsa efficacia dell’infezione retrovirale delle cellule di glioma in vivo (24). Trials di fase I e pilota sono stati anche eseguiti con il rilascio combinato della TK e interleukina-2 con risultati incoraggianti per quanto riguarda l’evidenziazione di effetti anticancro (69; Palu, comunicazione personale): la TK è stata rilasciata in masse di glomi maligni non operati con vettori adenovirali mediante stereotassi; sono tollerate dosi fino a 2 x 1011 di particelle virali, mentre dosi più alte hanno prodotto edema e flogosi (78). Questo effetto infiammatorio potrebbe attualmente facilitare l’effetto anticancro e potrebbe dare inizio ad una reazione immunologia contro le cellule tumorali. Altri geni, che sono stati rilasciati, includono quello che codifica la proteina di soppressione tumorale p53 (42; Lang, comunicazione personale).
Riscontri di traduzione minima da parte di vettori virali incapaci di replicarsi hanno stimolato l’interesse per virus che mantengono la capacità di replicarsi e crescere nelle cellule tumorali. Questi virus sono stati designati con il termine di virus oncolitici (11). Nella clinica sono stati o attualmente sono ancora usati per i tumori cerebrali virus basati su adenovorus, virus del herpes simplex 1 (61, 74), reovirus (86) e poliovirus (22).Allo stato attuale è stata dimostrata l’assenza di tossicità in oltre 50 pazienti. La dimostrazione dell’efficacia, probabilmente, richiederà il completamento di trials di fase II, ma è probabile che, per essere efficaci, richiederanno l’abbinamento con altre terapie.
Le terapie per disordini neurologici diversi dai glomi sono rimaste studi preclinici. L’ictus è stata un’ applicazione proficua; la conoscenza di processi patologici e di fattori, che conducono alla disfunzione dei neuroni, all’ischemia e alla distruzione del tessuto nervoso, ha comportato una scelta razionale di geni che possono essere usati per alleviare questi processi. Un review eccellente di Sapolsky e Steinberg (75) riassume numerosi concetti e studi in quest’area. Infatti, questi autori hanno eseguito la maggioranza degli studi sperimentali pubblicati (48, 49, 93, 94). La maggioranza degli studi in quest’area riflette una sola conclusione, il rilascio profilattico di geni neuro-protettivi anti-apoptosici è molto più efficace nell’inibire gli effetti dell’ictus in confronto al rilascio dopo che è già avvenuto l’ictus. Per i neurochirurghi queste scoperte non limitano l’importanza potenziale di questo tipo di terapia genica. Infatti diversi interventi neurochirurgici (come il clippaggio degli aneurismi, le procedure di embolizzazione e la resezione delle malformazioni artero-venose) sono associati al rischio di infarto e la terapia genica profilattica in queste circostanze può essere una valida aggiunta per il trattamento di questi pazienti.
In modelli animali di ictus il trasferimento di geni coinvolti nella modulazione delle reazioni infiammatorie ha dimostrato di provvedere alla neuro-protezione. Per esempio, il gene, che codifica l’antagonista del recettore dell’interleukina-1°, riduce il volume della sede di infarto del 64% dopo l’occlusione della arteria cerebrale media nei ratti (5). Anche il trasferimento di geni, che limitano l’apoptosi, è benefico. Due differenti studi dimostrano che il trasferimento del gene bcl-2, che inibisce l’apoptosi cellulare, limita il volume dell’infarto in modelli di ictus animale (48, 54). Un altro evento, che avviene durante la morte cellulare, è l’accumulo anomalo di calcio, che può attivare un certo numero di enzimi proteolitici. Il calbindin d28k lega il calcio e ne limita la tossicità. Infatti il trasferimento del gene calbindin d28k, dimostratamente, migliora la sopravvivenza dei neuroni soggetti a ischemia (94). Il ripiegamento erroneo di proteine è un altro avvenimento nelle cellule esposte a traumi come l’ischemia. La proteina-72-dello-shock-termico serve da accompagnatore intracellulare per le proteine erroneamente ripiegate, facendole divenire bersaglio per la degradazione. I livelli della proteina-72-dello-shock-termico sono aumentati durante l’ictus fornendo il razionale per studiare, se l’ulteriore aumento di espressione mediante transfer genico, possa fornire neuro-protezione. Il trasferimento del gene di questa proteina 72 migliorò la sopravivenza di neuroni, di oltre il 30%, dopo un ora dall’occlusione dell’arteria cerebrale media (93). E’ stato possibile ottenere significativa neuro-protezione anche se il trasferimento veniva effettuato 2 ore dopo l’inizio dell’ictus, ma non dopo 5 ore (27). . Questo illustra, ulteriormente, il periodo di tempo relativamente limitato disponibile per ottenere effetti biologici significativi nel periodo attorno agli eventi ischemici. Il peptide striatale natriuretico è un ormone con proprietà natriuretiche, ipotensive e diuretiche. Il suo trasferimento nella muscolatura cardiaca di una linea di ratti, che presentano ipertensione sensibile al sale, ha ridotto l’insorgenza di ictus in questi animali (53). Anche il trasferimento nel tessuto cerebrale del ratto esposto a ischemia per 90 minuti del gene codificante il fattore neurotrofico derivato da cellule gliali (GDNF) è stato benefico (79).
Uno studio recente ha fornito l’evidenza fisiologica che l’espressione nelle cellule avviene anche se i geni vengono rilasciati in aree cerebrali soggette a ictus; vi è comunque un effetto soglia, in quanto l’espressione dei geni è stata significativamente diminuita quando il flusso cerebrale era inferiore al 40%. Dato che le regioni peri-ischemiche del cervello dimostravano avere un flusso al di sopra di questo livello, è stato concluso che la terapia genica potrebbe essere più efficace per la zona in penombra piuttosto che per il centro dell’area di ictus (67). Infine la capacità della sintetasi endoteliale di ossido nitrico di migliorare la microcircolazione suggerisce un altro approccio di terapia genica, che può ridurre le conseguenze deleterie degli eventi ischemici (2, 47, 52, 90).
In conclusione, diverse strategie di trasferimento genico hanno dimostrato di fornire neuroprotezione in modelli animali di ictus. L’implementazione di trials clinici sarà necessaria per determinare se i risultati positivi persistono anche nei soggetti umani.
L’identificazione di proteine ossee morfogenetiche (BMP) come fattore critico nell’arruolamento e nella maturazione di cellule osteogenetiche fornisce una strategia per migliorare la fusione ossea (26). Questa è un eccitante area per le applicazioni neurochirurgiche della terapia genica, in quanto alcune delle limitazioni della corrente tecnologia di trasferimento genico potrebbero non essere restrittive. Queste limitazioni includono il quadro temporale transitorio dell’espressione genica e la natura focale del rilascio genico ad una piccola area di tessuto iniettato. La corrente tecnologia di terapia genica applicata alla fusione ossea, nella quale l’espressione genica deve durare soltanto un breve periodo di tempo, per promuovere la formazione ossea, e nella quale l’espressione deve interessare soltanto una specifica regione tissutale, sembra essere ideale.
Il trasferimento del gene BMP-2 nel muscolo del ratto atimico ha comportato la chemiotassi e proliferazione di cellule staminali mesenchimali con la conseguente differenziazione in condrociti. I condrociti hanno secreto una matrice cartilaginea, che poi è stata mineralizzata e sostituita da osso maturo (1). Nei ratti immunocompetenti, comunque, la formazione di osso non è stata così evidente a causa della risposta infiammatoria provocata dal vettore adenovirale usato in questo studio. Il trasferimento genico di BMP-9 nella muscolatura paravertbrale di ratti atimici risultò in massiccia formazione di osso in corrispondenza della sede di iniezione, comportando, chiaramente, un’artrodesi solida, senza evidenza di pseudoartrosi, compressione radicolare o effetti collaterali sistemici (25). Si può ottenere la fusione spinale anche con il trapianto di cellule staminali mesenchimali umane, che sono state tradotte ex-vivo con BMP-9, al posto di iniettare i vettori nella muscolatura spinale (14). Il gene della proteina-1-LIM-mineralizzante codifica una proteina intracellulare, che induce la formazione di diversi fattori di crescita ossea. La fusione spinale solida è stata osservata in 4 settimane in tutti i dieci conigli, che hanno ricevuto cellule infette con un vettore adenovirale esprimente la proteina-1-LIM-mineralizzante, ma non è stata osservata in nessuno dei 10 conigli che sono stati infettati con cellule infette da adenovirus vuoto. L’esame biomeccanico e istologico dei campioni trattati con vettore adenovirale della proteina-1-LIM-mineralizzante ha fatto riscontrare dati, che hanno confermato una fusione spinale di elevata qualità (81). Pertanto il rinforzo della fusione spinale, sia con iniezioni di cellule staminali espressive di geni osteoinduttivi sia l’iniezione diretta di vettori alberganti questi geni, sembra essere destinato divenire un applicazione clinica di terapia genica.
Bisognerebbe fare attenzione che un trial clinico, nel quale BMP-2 è stato usato senza rilascio genico, sembra essere stato efficace. La conclusione di questo trial è stata, che BMP-2 ha indotto con o senza fissazione interna fusione spinale postero-laterale radiografica in pazienti la cui spondilolistesi non eccedeva il grado 1. Un miglioramento statisticamente più rilevante e più veloce è stato misurato nel decorso clinico di pazienti del gruppo rhBMP-2 (8). Pertanto, è possibile, che incrementando il tempo di espressione della BMP-2 con la terapia genica, si ne possa determinare l’evidenza ancora maggiore di efficacia, anche se questa ipotesi richiederà una valutazione formale.
La deplezione dei neuroni produttori di dopamina nella substantia nigra di pazienti con malattia di Parkinson ha fornito un bersaglio per approcci di terapia genica. Le vie metaboliche biochimiche della sintesi di dopamina coinvolgono diverse reazioni enzimatiche che conducono dall’aminoacido tiroxina fino al metabolica finale, dopamina. Pertanto, è stata studiata la sostituzione di queste attività enzimatiche con l’iniezione diretta di vettori di trasferimento genico (9, 15, 17, 18, 28, 29, 31, 37, 39-41, 43, 44, 58-60, 68, 77, 85) o con l’iniezione di cellule che sintetizzano questi enzimi (3, 6, 32, 34, 55, 87) in modelli della malattia di roditori e primati non umani. Risultati biologicamente significativi stanno conducendo i principali ricercatori verso potenziali applicazioni cliniche (15, 33).
Il trasferimento genico è stato studiato usando come vettori virus adeno-associati (AAV), adenovirali, lentivirali e virus herpes simplex. Il trasferimento del gene, che codifica la tirosina idrossilasi (TH), è stato associato con miglioramento comportamentale nei modelli di parkinsonismo murino e dei primati. Per incrementare ulteriormente la produzione di dopamina sono state studiate strategie, che coinvolgono il trasferimenti di geni, che codificano la TH e la decarbossilasi dell’aminoacido L-aromatico (AADC) e/o la cicloidrosilasi del guanosin-trifosfato I (GHC). Queste strategie hanno determinato ancora più significativi miglioramenti della funzione in modelli animali della malattia. Per esempio, quando sono state iniettate unilateralmente nel putamen di scimmie trattate con 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (un modello sperimentale di degenerazione nigro-striatale in primati risultante in parkinsonismo) miscele di tre vettori esprimenti TH, AADC e GCH, sono stati osservati notevoli miglioramenti della abilità manuale controlateralmente alla sede delle iniezioni di AAV-TH/AAV-AADC/AAV-GCH (64). Il periodo di miglioramento è durato per mesi, durante il tempo di osservazione di quattro scimmie, con la presenza in ampie zone del putamen di cellule immuno-reattive a TH, AADC e GCH. La microdialisi ha dimostrato, che le concentrazioni di dopamina nei putamen trattati con AAV-TH/AAV-AADC/AAV-GCH erano aumentate rispetto al lato di controllo. Il rilascio convection-enhanced dimostratamente fornisce un rilascio più significativo di vettori nei cervelli animali consentendo una più efficace espressione del gene rilasciato nel tessuto cerebrale bersaglio (4). Con questa strategia la tomografia ad emissione di positroni (PET) e appropriati traccianti possono essere usati per monitorizzare la terapia genica in vivo (4). Un'altra recente strategia coinvolge il trasferimento della decrbossilasi dell’acido glutammico, l’enzima che catalizza la sintesi del neurtrasmettitore acido gamma-amnino-butirrico, per eccitare i neuroni glutaminergici del nucleo subtalamico del ratto (56). I neuroni transdotti, se stimolati elettricamente, hanno prodotto risposte inibitorie miste associate a rilascio di acido gamma-amino-butirrico. Questo shift fenotipico ha avuto come risultato una forte neuro-protezione dei neuroni dopaminergici e la correzione del fenotipo comportamentale parkinsoniano.
Un altro approccio usato nella terapia genica del morbo di Parkinson riguarda il rilascio di geni neuroprotettivi, come il GDNF. In uno dei primi studi, che ha dimostrato l’efficacia di questo approccio, è stato iniettato in prossimità della substantia nigra un vettore non replicantesi adenovirale, che codificava il GDNF umano ed è stato osservato, che proteggeva i neuroni dopaminergici dalla progressiva degenerazione indotta dalla neurotossina 6-idrossidopamina iniettata nello striato (12). La terapia genica adenovirale con GDNF riduce la perdita di neuroni dopaminergici di tre volte, dopo l’induzione della lesione con 6-idrossidopamina, in confronto a nessun trattamento o all’iniezione di adenovirus che esprimono LacZ o mGDNF (che codificano un mutante - mediante delezione - biologicamente inattivo del GDNF). In aggiunta, un vettore lentovirale esprimente GDNF è stato iniettato nello striato e nella substantia nigra di scimmie rhesus anziane o di giovani adulti di scimmie rhesus, che una settimana prima erano state trattate con la neurotossina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (40). In tutti gli animali è stata osservata un estesa espressione di GDNF, con trasporto antero- e retrogrado. Nelle scimmie anziane il lenti-GDNF aumentava la funzione dopaminergica. Negli animali trattati con neurotossina il lenti-GDNF faceva regredire i deficit neurologici e preveniva completamente la degenerazione nigrostriatale. Inoltre, l’iniezione di lenti-GDNF in scimmie rhesus intatte mostrava una espressione a lungo termine del gene (8 mesi). Nelle scimmie trattate con neurotossina il trattamento con lenti-GDNF faceva rientrare i deficit motori durante un esercizio di abilità manuale. Questi studi hanno dimostrato la fattibilità dell’uso del trasferimento del gene del GDNF per migliorare i sintomi parkinsoniani nei primati.
In aggiunta alle abituali riserve associate agli approcci mediante terapia genica sul sistema nervoso centrale, nel caso del morbo di Parkinson, vi sono state riserve ulteriori che la correzione permanente, ma incontrollata, della produzione di dopamina nello striato possa portare a discinesie intrattabili (66). Pertanto, si ha bisogno di una terapia genica con elementi promotori regolabili per permettere la modulazione in vivo dell’espressione genica (65,88,92).
Vi sono stati casi ben pubblicizzati di tossicità maggiore associata alle terapie geniche e che richiedono una menzione particolare. Il primo di questi casi riguarda un giovane adulto con un errore innato del metabolismo, che in un trial clinico è stato trattato con l’iniezione nell’arteria epatica di un vettore adenovirale non replicatesi, che trasportava il gene dell’enzima mancante. Il paziente è morto in seguito al rapido sviluppo di insufficienza multi-organo, che si pensa possa essere derivata da una massiccia risposta in fase acuta al vettore. Le indagini su questo tipo di risposta immune acuta sono pertanto diventate un importante area di studi di laboratorio. Le considerazioni sul conflitto di interesse dei ricercatori, sul consenso informato del paziente e sui valori di laboratorio pre-procedurali all’arruolamento del paziente sono stati fattori, che hanno composto il dibattito dopo lo spiacevole esito di questa esperienza. La comunità dei ricercatori in terapia genica ha, da allora, adottato numerose politiche per squalificare dalla partecipazione ai trial ricercatori con interessi finanziari e ha aumentato la supervisione del governo e istituzionale sulla condotta dei trial clinici.
Più recentemente è stato osservato lo sviluppo di linfomi in due bambini su undici trattati per immunodeficienza severa combinata legata al cromosoma X (23). Questo disturbo ha un esito uniformemente fatale. Neonati con questa malattia sono stati trattati in Francia con cellule staminali CD34+ derivate da midollo osseo transdotte con un fattore retrovirale codificante la comune proteina transmembranica della catena gamma condivisa con i recettori per l’interleuchina 2, 4, 7, 9, 15 e 21. Tutti i neonati hanno avuto maggiori miglioramenti clinici, che prima non era stato impossibile ottenere con alcuna terapia Nove pazienti su undici hanno presentato dopo il trapianto un sistema immunitario essenzialmente normale. Tre anni dopo il trapianto due degli undici bambini hanno sviluppato una leucemia linfoblastica acuta a cellule T. Gli studi hanno dimostrato che la leucemia è stata il risultato diretto della mutagenesi inserzionale del vettore retrovirale sul gene Lmo-2 delle cellule staminali, che ha comportato una produzione aberrante della Lmo-2 proteina, che, a sua volta, ha contribuito alla crescita anomala delle cellule. La Food and Drug Administration ha così sospeso negli Stati Uniti tutti gli studi di trasferimento genico che coinvolgessero vettori retrovirali nel sistema ematopoietico. Il National Institutes of Health Recombinant DNA Advisory Committee si è riunito recentemente (10 Febbraio 2003) ad hoc per discutere questi eventi avversi. Sono state fatte le seguenti raccomandazioni: 1) mancando dati addizionali o essendoci circostanze estenuanti, verificato caso per caso, la terapia genica mediante trasferimento retrovirale per l’immunodeficienza severa legata al cromosoma X deve essere limitata a pazienti, nei quali sono stati fallimentari trapianti di cellule staminali identiche o aploidentiche o per i quali è stato impossibile identificare un utile donatore di cellule staminali. Gli esami caso-per-caso dovranno includere analisi rischio-beneficio appropriate accompagnate da un consenso informato ulteriormente migliorato e da piani di monitoraggio; 2) in questo momento non ci sono dati sufficienti o reports di effetti avversi direttamente attribuibili all’uso di vettori retrovirali, che comportino la minaccia di cessazione di altri studi di trasferimento mediante retrovirus in umani, inclusi quelli per il trattamento della immunodeficienza combinata severa non X-linked. Questi studi dovranno essere giustificati da appropriate analisi rischio-beneficio, accompagnate da più esteso consenso informato e piani di monitoraggio. Queste raccomandazioni non sono state ancora implementate dalla Food and Drug Administration.
Nonostante la pubblicità negativa e rare applicazioni disastrose, gli investigatori in terapia genica sembrano capire i motivi dei problemi che ne hanno reso inefficace l’uso nell’uomo. Con queste conoscenze sembra che inizino ad emergere soluzioni, che probabilmente porteranno alla luce dati che dimostreranno che la terapia genica può trattare malattie neurologiche. E’ interessante notare che la prima applicazione della terapia genica per una malattia (il tentato rilascio di un gene che invertiva il decorso di una severa immunodeficienza combinata in bambini) alla fine, dopo un decennio di attivi studi, si è dimostrata utile nel curare i bambini affetti. Per dimostrare i benefici della terapia genica nelle malattie neurologiche saranno necessari un uguale perseveranza e focalizzazione.
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